凯基细胞凋亡DNA Ladder检测试剂盒
（ApotosisDNA Ladder Detection Kit）
Cat number：KGA For Research Use Only
Store at-20℃ for one year
Expire date：
一、试剂盒说明
细胞核染色质DNA断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性降解染色质DNA，形成50-300 kb的大片段，并进而在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的DNA片段，这些DNA片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色呈现为梯状条带（DNA Ladder），并据此判断细胞凋亡产生。凯基细胞凋亡DNA Ladder检测试剂盒提供了一种简便、快速地提取染色质DNA的方法，并增加对小片段DNA的回收，从而增强了检测的敏感性。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不*用于检测组织样本）。
二、试剂盒组份
| 组份 | Cat:KGA111（20 assays） | Cat:KGA112（50 assays） | Cat:KGA113（100 assays） | 储存条件 |
| Lysis Buffer | 4 mL | 10 mL | 20 mL | 4℃ |
| Solution A | 400μL | 1.0 mL | 2.0 mL | -4℃ |
| Enzyme A | 400μL | 1.0 mL | 2.0 mL | -20℃ |
| Enzyme B | 400μL | 1.0 mL | 2.0 mL | -20℃ |
| Precipitant | 3.0 mL | 6.5 mL | 13.0 mL | 4℃ |
| Loading Buffer | 80μL | 0.2 mL | 0.4 mL | 4℃ |
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
高速离心机、微量移液器、涡旋振荡器、凝胶电泳仪、37-55℃水浴
1.5m L Microtube、PBS、*消化液、冰乙醇、TE Buffer，琼脂糖，TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker
四、使用注意事项
1. DNA Ladder出现在细胞凋亡晚期，观察细胞形态已发生皱缩出芽，染色质*凝聚，细胞核已固缩断裂的凋亡晚期形态，建议该种形态的凋亡细胞比例在30%以上时进行DNA Ladder检测或*行Tunel检测，
2. DNA Ladder出现在一个较短的时间段，在凋亡早期取样，则无DNA降解的条, 带，而在凋亡末期取样则产生与细胞坏死相似的DNA弥散条芾。因此取样时间需根椐不同种类的细胞和诱导剂而摸索确定。
3. 贴壁细胞不用*消化而用细胞刮收集。
4. 某些细胞不产生这种核小体间的DNA断裂，而是产生50-300kb的大片段断裂。
五、操作方法
1． 离心收集105~106细胞（1500×g，离心5min）于1.5mL微量离心管中；
2． 用PBS洗涤细胞二次（1500×g，离心5min），弃上清；
3． 沉淀的细胞中加入100μL Lysis Buffer，涡旋振荡器上剧烈混合10秒， 1000×g，离心5min后移上清于另一1.5mL微量离心管中；
4． 沉淀再加入100μL Lysis Buffer重复上步，合并两次的上清液；
5． 在上述合并的上清液中加入20μL Solution A，再加入20μL Enzyme A， 55℃反应1小时；
6． 加入20μL Enzyme B,37℃孵育1小时；
7． 加入130μL Precipitant和950μL冰乙醇, 混匀，置—20℃,1小时以上或过夜；
8． 4℃，12，000-14，000 rpm离心15-30min，小心地弃去上清，收集沉淀的DNA；
9． 加入0.5mL 70%的冷乙醇，洗DNA沉淀，再12，000-14，000 rpm离心20min；
10．弃上清，DNA沉淀于室温干燥10 min后，加入10-15μL TE Buffer，充分搅拌溶解DNA；
11．取上述10-15μL样品加入2-3μL Loading Buffer， 1.5%琼脂糖凝胶电泳（凝胶和电泳缓冲液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶）；
12．5V/cm电泳1小时，紫外灯下观察并拍照。
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