TRAP－PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒
凯基TRAP－PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒
（TRAP-silver staining omerase Detection Kit ）
Cat number：KGA412 For Research Use Only
Store at-20℃ for one year
Expire date：20101208
一、试剂盒说明
端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒（omere）是真核生物染色体的天然末端，由上千个6碱基重复序列组成（TTAGGG）组成，是细胞必需的遗传组分，它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程的准确性，以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变得越来越短，当端粒短到一定程度就会发出信号，细胞停止分类。
端粒酶由RNA和蛋白质亚基组成，是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达，而肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常的高表达。因此对组织或细胞中端粒酶活性的检测具有重要意义。TRAP－银染法端粒酶活性检测试剂盒是采用端粒重复序列扩增的方法，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带，条带的深浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，同时缩短了检测所需的时间，避免了同位素的放射污染。
本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织端粒酶活性检测，与通常的端粒酶活性测定法相比较，具有以下特征：
内标与端粒酶提取液在同一管中进行PCR扩增，提高了检测的准确性；
优化引物设计，是PCR效果进一步提高
二、试剂盒组份
| 组份 | KGA412 （20 assays） | KGA413 （50 assays） | KGA414 （100 assays） | 储存条件 |
| Wash buffer | 20 mL | 50 mL | 100 mL | 40C |
| Lysis buffer | 1.2mL | 3.0 mL | 5.0 mL | 40C |
| 10×TRAP buffer | 100μL | 250μL | 500μL | 40C |
| dNTPs | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| Taq-DNA polymerase | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| TS primer | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| CX primer | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| 内标引物 | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
高速冷冻离心机、涡旋振荡仪、PCR扩增仪、微量移液器、DEPC水处理并灭菌的枪头、离心管等
PBS、1M DTT、PMSF（100mM溶于异丙醇）、0.5Mβ-巯基乙醇、DEPC水
蛋白定量试剂及仪器（可选购凯基Bradford法或BCA蛋白浓度测定试剂盒）
聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染相关仪器及试剂（具体参见操作方法）
四、操作方法
建议使用经DEPC水处理并灭菌的枪头、离心管等实验器材
1． 细胞端粒酶或组织标本端粒酶的提取
1.1 用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~2×106细胞；若是组织标本，称取40-100mg左右的组织，用PBS洗涤后，研碎；
1.2 加入1ml冰冷的Wash buffer （使用前每ml Wash buffer中加入1μL 1M的DTT），悬浮上述样品，置冰上5min；
1.3 4oC，离心 （10,000 rpm，5min），弃上清；
1.4 加入40μL冰冷的Lysis buffer [使用前每ml Lysis buffer中加入2μLβ-巯基乙醇（0.5M溶于水，一般市售纯液体为14.3M）]，悬浮沉淀，涡旋振荡10s，置冰上30min，其中间隔数分钟，涡旋振荡一次，共3～5次；
1.5 4oC，离心 （13,000 rpm，30min）；
1.6 转移上清，分装3-4管，每管约20μL。其中一份样品进行蛋白质浓度测定，其余迅速冷冻，-70℃保存。
1.7 浓度测定后，根据结果zui后用Lysis buffer调浓度至1μg /μL，用于下一步实验。
2． PCR扩增
1.1 吸取2.5μL 10×TRAP buffer，另加入0.5μL dNTPs， 0.5μL TS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入19.5μL ddH2O，于PCR扩增仪上23 oC保温30min；
注：蛋白上样范围较广，可从10ng～10μg，建议根据实际情况调整。
1.2 上述各管中加94℃加热1分钟灭活。
1.3 向上述各管中加入2.5μL 10×TRAP buffer，0.5μL dNTPs，0.5μL TS primer，1μL CX primer，0.5μL Taq-DNA polymerase，18μL ddH2O，混匀，于PCR扩增仪上进行扩增：
94 °C，3 min；
94 °C，30s；45°C，35s；72 °C，90s；5个循环；
72 °C，延伸60s。
1.4 在上述扩增结束时，暂停仪器运行，快速向各管中加入内标模板1μL，内标引物1μL。继续运行仪器，进行以下的扩增实验：
94 °C，60s；
94 °C，40s；60°C，35s；72 °C，50s；35-36个循环；
72 °C，延伸10min。
以下步骤的试剂需用户自备：
3． 聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.1 制备10％非变性聚丙烯酰胺凝胶（20ml）
| 37％Acr－Bis（36：1） | 5.46 ml |
| ddH2O | 12.4 ml |
| 10×TBE | 2 ml |
| 10％APS | 125μL |
| TEMED | 15μL |
3.2 电压17.5V/cm，电泳Buffer：0.5×TBE，所制凝胶垂直电泳预跑1-2小时；
3.3 取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，在电压17.5V/cm，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳50～60min；
4． 银染
4.1 将凝胶置10％乙酸固定30min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次5min；
4.2 将凝胶置于0.2 g/L*浸泡1min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次30s；
4.3 将凝胶置于*染液浸泡30min，然后用蒸馏水漂洗15s；
4.4 将凝胶置于显色液中显色10min左右直到全部条带显色为止；
4.5 zui后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。
用户自备试剂配方：
*染液（100mL） 10×上样缓冲液（10mL）
0.2g * 25mg 溴酚兰
25μL 37％甲醛 4g 蔗糖
定容至100mL 定容至10mL
10×TBE（pH=8.3） （100mL） 显色液（100mL）
10.8g Tris 3g 碳酸钠
5.5g 硼酸 25μL 37％甲醛
4ml 0.5M EDTA 0.4mg *
定容至100mL 定容至100mL
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