M1（AFM1）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
1  使用目的：
本试剂盒用于检测饲料和谷物中M1（AFM1）含量。
2  实验原理
本试剂盒采用直接竞争 ELISA方法，在微孔板包被有M1（AFM1）偶联抗原，
加入 M1（AFM1）标准品或样品，游离 M1（AFM1）与微孔条上预包被
的M1（AFM1）偶联抗原互相竞争抗  M1（AFM1）抗体酶标记物，用  TMB
底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为，用酶标仪在  450nm  波长下进行检测，吸光
值与样品中 M1（AFM1）含量成反比，通过标准曲线计算样品中M1（AFM1）
的含量。
3  M1（AFM1）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书试剂盒组成
3.1 预包被的 AFM1偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
3.2 AFM1标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：    0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7
ng/ml,8.1 ng/ml。
3.3抗  AFM1抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3.4显色液  A：1瓶（6ml）。
3.5显色液  B：1瓶（6ml）。
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7样本稀释液：1瓶（10×,      6ml），用于样品稀释用。
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9说明书一份。
4  需要而未提供的材料
4.1  设备
4.1.1波长450nm酶标仪。
4.1.2粉碎机。
4.1.3量筒。
4.1.4振荡器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman 或相当的滤纸。
4.1.7微量移液器。
4.2  试剂
4.2.1去离子水或蒸馏水。
4.2.2  甲醇。
5  贮存
5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻
5.2  未用完的微孔板应该密封干燥保存
6  M1（AFM1）酶联免疫分析ELISA试剂盒使用说明书注意事项
6.1  使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2不要使用过期试剂盒。
6.3试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
6.4标准品中含有M1（AFM1），使用时应特别注意，操作时应带手套。
6.5终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6.6不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
6.7不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响
实验结果。
6.8稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
6.9混合试剂时应避免起泡。
7工作液准备
7.1M1（AFM1）标准品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml
7.2浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用
7.3样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用
7.3显色剂：已备用，避免光线直照
7.4反应终止液：已备用
8样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则
会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的样品，加  20ml 70%甲醇溶液
8.2强力振荡3分钟
8.3用Whatman 滤纸过滤
8.4取25µl处理后的样品，加入25µl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）
9酶免分析步骤
9.1实验须知
9.1.1实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室
温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的度和准确度。
9.1.2使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
9.1.3请不要改变分析程序
9.1.4请使用的微量移液器
9.1.5操作一旦开始，请不要中断任何程序
9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
9.1.7为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9.1.8加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
9.2分析步骤
9.2.1预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
9.2.2取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)
9.2.4在B0孔中加入50µl   0.0 ng/ ml标准品溶液
9.2.5在各标准孔中加入50µl的标准品溶液
9.2.6在各样品孔中加入50µl样品溶液
9.2.7在所有孔中加入50µl的抗M1（AFM1）抗体酶结合物
9.2.8轻轻晃动反应板几秒钟。
9.3 37℃温浴30min（温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
9.3.1甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液体。
9.4反应
9.4.1洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加    50µl显
色液B；轻微晃动反应板使之*混匀
9.4.2 37℃温浴10min
9.4.3每孔中加入50µl终止液，混匀
9.4.4在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
10结果计算
10.1定量分析
10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以*个标准（0标准）
的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
10.1.2以M1（AFM1）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。
根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为 M1（AFM1）浓
度的对数值，求得反对数即为测定液中M1（AFM1）浓度C（ng/ml）
10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释
倍数。
10.2半定量测定
10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光
度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色
深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
11特异性
物质交叉反应
12试剂盒参数
本试剂盒检测下限为0.1ppb
B0吸光度值应大于1.0
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。
13标准曲线模式（仅供参考）
试剂盒提供的标准曲线范围为
0.1ng/ml~8.1ng/ml3。