荧光素标记金属蛋白酶组织抑制因子-4抗体IgG，Anti-TIMP-4/FITC

抗体的制备——多克隆抗体的制备 
*动物的选择 
*佐剂（adjuvant） 
*免疫方法 
*免疫剂量 
*抗体效价的测定 
*放血或定期抽血 
（1） 动物的选择 
选择什么动物来免疫取决于： 
*所需抗血清的量 
-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。 
*能供免疫用的抗原量 
g足够，而山羊需要几毫克。m-小鼠50 
（1） 动物的选择（续） 
*动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。 
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。 
-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性）为zui常用。 
（2） 佐剂 （adjuvant） 
*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。 
*zui常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为: 
-弗氏不*佐剂（Freund's incomplete adjuvant） 
-弗氏*佐剂（Freund's complete adjuvant） 
弗氏不*佐剂 
（Freund's incomplete adjuvant, FIA） 
*是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。 
*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。 
弗氏*佐剂 （Freund's complete adjuvant, FCA） 
*在弗氏不*佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2～20mg/ml），即成为FCA。 
*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后（油包水）注入动物。 
-一般注射时用*佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不*佐剂或不用佐剂。 
佐剂与抗原乳化的方法 
*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原 
-先将不*佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体*分散。 
-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。 
*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。 
佐剂与抗原乳化的方法（续） 
*注射器混合法 
-将等量的*佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。 
*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。 
*缺点：不易乳化，时间长。 
佐剂与抗原乳化的方法（续） 
*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。 
-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。 
-每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可*乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。 
*优点：简单、快速、节省材料。 
乳化剂的鉴定 
*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。 
（3） 免疫方法——免疫途径 
*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。 
*一般采用多点注射方法 
-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。 
-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。 
（3） 免疫方法——免疫途径 （续） 
*几点说明： 
-大动物一般不用腹腔注射 
-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射 
g抗原即可获得较好的免疫效果。m-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100 
-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。 
（3） 免疫方法——次数及间隔时间 
*次数一般为2～3次（初次免疫和加强免疫） 
-注射后，10～15天再加强注射； 
-剂量同或为的一半，用不全佐剂或不用佐剂。 
*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长 
-豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天； 
-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。 
举例1：家兔的免疫 
*初次免疫 
g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；m-用50～200 
*两周后，加强免疫 
g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；m-将50～200 
*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血 
-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。 
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔 
*一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔 
-先在其两脚垫注射*福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）； 
-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，*次注射抗原用*福氏佐剂混合乳化； 
g；m-以后每隔20天用不*福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50 
-末次注射两周后兔耳放血测价 （可达1:128）。 
举例3：豚鼠和大鼠的免疫 
*初次免疫 
g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；m-用10～100 
*加强免疫 
g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；m-每隔 7～8天，将10～50 
*抗体效价的检测 
（4） 免疫剂量 
*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制； 
*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。 
（4） 免疫剂量 （续） 
*各种动物免疫抗原剂量和加强免疫的剂量 
（5） 抗体效价的检测 
多采免疫双向扩散法