CSTM团体标准《小分子有机化合物 内标法定量分析 核磁共振氢谱法》征求意见

　　【仪表网 行业标准】中国材料与试验标准化委员会科学试验标准化领域委员会科学试验装置标准化技术委员会(CSTM/FC98/TCO3)归口承担的《小分子有机化合物内标法定量分析核磁共振氢谱法》团体标准(立项号:CSTM LX 9803 01135——2022)已完成征求意见稿，按照《中关村材料试验技术联盟团体标准管理办法》的有关规定，现公开广泛征求意见。
 

　　核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)波谱法是一种基于特定原子核性质的分析方法，它通过原子核在特定外磁场中吸收与其裂分能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振信号。核磁共振现象自1945年被发现以来，广泛应用于有机化合物的分子结构、分子间的相互作用和分子动力学研究等，近些年来逐渐应用于定量研究。定量核磁共振(quantitative Nuclear Magnetic Resonance, qNMR)具有许多优点，它是一种直接分析法，测定过程中不会破坏待测样品结构或组分，通用性强，分析时间短，其最大的优点是其用于含量测定时，不需要获取目标化合物的自身标准物质。色谱法在含量测定中的优点是其具有高灵敏度和高专属性，但缺点是需要自身标准物质，获取自身标准物质需要耗费大量的时间和资金，有时即使投入成本很多，也难以获得，而核磁共振氢谱法正好可以克服这个缺点。
 

　　尽管理论上任何能产生核磁共振信号的原子核都能做定量研究，但由于受原子核自身特性如磁旋比、天然丰度等影响，导致各原子核的核磁共振谱图的分辨率和灵敏度差异较大。而定量核磁共振对检测谱图分辨率及灵敏度要求较高，且氢核的灵敏度和天然丰度较高。故在实际应用中，氢谱定量核磁共振(quantitative Proton Nuclear Magnetic Resonance, 1H qNMR)的使用较为广泛。
 

　　核磁共振氢谱定量法有相对定量和绝对定量两种方式。相对定量是基于待测样品中每个组分特征峰的积分面积，检测特定组分间的相对含量。一般应用于测定样品中杂质的相对含量，或者混合物中各成分相对含量。绝对定量是采用标准物质，通过比较样品的特征峰面积与内标峰的峰面积计算样品的含量。绝对定量在使用时有内标法和外标法，一般而言，内标法的准确性优于外标法，目前国际上的相关标准中推荐采用的也是内标法。
 

　　在核磁共振用于小分子有机化合物的定性研究时，有比较成熟完善的管理规范和指导原则，如教育部制定的《超导脉冲傅里叶变换核磁共振方法通则 JY/T 0578-2020》等，而在用于定量研究时，其对仪器设备、实验参数、待测物特性以及人员操作等要求偏高，与之相关的管理规范尤其是实际应用方面的指导原则比较少，极大地限制了定量核磁共振的发展。但是目前核磁共振定量检测和分析领域缺乏统一的标准和规范，极大的限制了定量核磁技术的应用发展。因此，为推动核磁共振氢谱定量分析法在分析检测、含量测定等方面的应用，满足该技术在科研和相关行业研发的需求，制定我国核磁共振氢谱内标法定量分析的操作标准势在必行。
 

　　本文件为首次发布。本标准适用于小分子有机化合物(分子量≤900)的绝对定量中的内标法而拟定的，因此，本文件适用于核磁共振氢谱的内标法定量分析。
 

　　实验采集：
 

　　1.弛豫延迟时间D1 根据待测样品和内标物特征峰的纵向弛豫时间T1 来设置弛豫等待时间D1，D1 的设置应大于 5 倍T1，当D1 设置为 7 倍的T1 时间时，99.9%可以获得弛豫，当D1 设置为 5 倍的T1 时间时，99.3%可以获得弛豫，这意味着 7 倍T1 的等待时间可以将误差从 0.7%降低到 0.1%，这对于整个准确度要求控制在 1.0%内时非常重要。在有机化合物中，一般质子的弛豫时间都小于 10s，只有一些小分子例外，如甲酸钙和某些对称性非常高的分子，需要注意的是这些化合物由于特征峰明显，经常被选为内标物，这时候实验时间会增长。弛豫延迟时间D1，脉宽的长度和采集时间构成了每次采集的重复时间，只要整个的重复时间达到 70s，即可达到 99.9%的弛豫，达到所需的准确性，因此，D1 设置为 63s较为适宜。
 

　　2.激发角度 采用 90°角激发。与常规氢谱采集时一般采用 30°角激发相比，90°角激发可以获得其两倍的信噪比(要获同样的信噪比，若用 30°角激发的话，扫描次数要翻 4 倍)。完全弛豫一般要求D1 等待时间是特征峰和内标物峰质子中较长弛豫时间的 7 倍，而 30°角激发，D1 等待时间仅能缩短到 6 倍的特征峰和内标物峰质子中较长弛豫时间。因此，90°角激发是更好的选择。
 

　　3.采集时间 采集时间 5-8s足够，一般采用 7s。采集时间由采样点数和谱宽决定。采集时间需要足够的长，能够覆盖完整的FID信号，但也并不是越长越好，若自由感应衰减信号消失后，采集到的仅是噪音信号。
 

　　4.扫描次数 采集次数是根据所选择的特征峰要求的信噪比来决定，信噪比需要达到 150：1 以上，而信噪比对核磁积分的准确度有非常重要的影响。信噪比对积分的影响用相对标准偏差来估算(公式RSD=86/SN)，若信噪比为 86，那么对积分带来的不确定度为 1%。信噪比与采集次数的平方根成正比，这意味着若要得到翻倍的信噪比，需要 4 倍的采集时间来获得。
 

　　5.发射中心 发射中心应设置在待测物的特征峰和内标物的特征峰的中间，避免由于未能均匀激发造成的偏差。
 

　　处理和处理参数：
 

　　1.零填充 零填充可以增加积分的准确性，将处理参数中的 SI 设置为采集参数中的 TD 若干倍数即可，如设置 SI=2*TD 可以满足要求。
 

　　2.窗函数 如果由于样品量不够或者采集时间过长造成信噪比过低，可以通过添加窗函数 LB(0.2~1 Hz)来提高信噪比，如将氢谱的窗函数 LB 设置为 0.3。值得注意的是，添加窗函数会导致图谱的分辨率降低。
 

　　3.相位调整 相位调整可以采用自动相位调整，若自动相位调整未达到预期目的，可以采用手动相位调整。
 

　　4.基线校正 基线校正可以采用自动基线校正，若自动基线校正未达到预期目的，可以采用手动校正。
 

　　5.积分 为保证 99%的峰面积的准确积分，积分区域应至少保证为半峰宽的 20 倍，如果这个区域范围出现峰的重叠，可以适当缩窄这个范围，但是必须同时对目标化合物和内标物的特征峰范围进行缩窄。
 

　　此外，如果 13C 的卫星峰出现，对目标化合物和内标物的特征峰进行积分时，要么同时包含卫星峰，要么同时都不含卫星峰。若峰重叠无法用改变溶剂或者其他手段实现，这时可以采用峰去卷积的办法。
 

　　更多详情请见附件。