SPA的纯化

2024-10-27 07:20:09来源：上海士锋生物科技有限公司阅读量：0

导读：

1.DEAE-Sephadex A-25离子交换层析法

⑴ 用0.1mol/L NH₄HCO₃缓冲液平衡DEAE-Sephadex A-25柱。
　　⑵ 加样后，用0.1mol/L NH₄HCO₃缓冲液洗脱12h~14h。
　　⑶ 改用0.4mol/L NH₄HCO₃缓冲液洗脱，流速0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，测OD275nm。
　　⑷ 测SPA活性（以对流免疫电泳），能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。
　　⑸ 浓缩或冻干保存。

2.Sphadex G100凝胶过柱法

装柱、加样，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，如上法测定活性和蛋白含量。

3.亲和层析法

(1)猪IgG的制备：取正常猪血清，硫酸铵提取球蛋白，再过DEAE-纤维素-32柱，制得纯化的IgG，以0.1mol/L NaHCO₃液平衡，配成4mg~5mg/ml溶液。
　　(2)偶联：将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中，倾入容积为15ml的Sepharose-4B中，搅拌，同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0，反应8min，用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO₃在2号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose-4B（在90Sec内洗脱完毕），迅速加入IgG液15ml，于4℃缓慢搅拌过夜，次日以PBS充分洗涤，至洗出液OD280nm<0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封闭残余活性基团，再以PBS洗至中性为止。
　　(3)PBS亲和层析：将粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG-Sepharose-4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD280nm<0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3-盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液，即为纯化的SPA，对流电泳检查SPA活性，收集，浓缩，保存。

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